KLD-мутагенез
Подготовьте замену, вставку или делецию в плазмиде и получите праймеры с планом PCR и KLD-реакции
Задайте мутацию
Замена последовательности
Метод и границы подбора
Выбирается пара из нескольких кандидатов. Tm участка отжига рассчитана по модели SantaLucia / Owczarzy с учётом dNTP; вторичные структуры полных праймеров — Primer3 2.6.1. Для длинных праймеров используется обозначенная эвристическая оценка.
На загруженной матрице проверяются точные совпадения участка отжига и последних 12 нт по обеим цепям. Также проверяются участки с 1–2 заменами без вставок и делеций, с отдельным учётом последних 5 нт. Другие ДНК не проверяются. Предпочтение отдаётся уникальным участкам отжига и меньшей Tm вторичных структур. Запас 10 °C в ранжировании — эвристический ориентир, не экспериментальный порог. Ранжирование не является прогнозом выхода ПЦР.
Координаты считаются с 1, границы делеции включены. При переходе через начало кольца начало экспортируемой последовательности переносится к новому стыку. Участки отжига: 14–32 нт, неперекрывающиеся. Вставки и замены длиннее 6 нт распределяются между двумя хвостами; сравниваются три варианта разделения около середины. Лимит вводимой последовательности 150 нт — ограничение инструмента, не гарантия эффективности мутагенеза.
Проверка специфичности ограничена загруженной кольцевой матрицей. Расчёт выполняется в браузере. Tm не равна температуре отжига ПЦР; стандартные модельные условия совпадают с Tm-калькулятором.