Сборка Гибсона
Рассчитайте праймеры и перекрытия для сборки кольцевой плазмиды из 2–5 фрагментов ДНК.
1. Фрагменты будущей плазмиды
Добавьте неперекрывающиеся участки в порядке 5′ → 3′. Первый фрагмент соединится с последним. Готовые перекрытия во входных последовательностях будут продублированы.
Метод и ограничения
Каждый входной фрагмент — участок отдельной линейной ПЦР-матрицы длиной 50–100 000 п.н. Границы фиксированы. Последовательности исходных векторов за пределами этих участков неизвестны и не проверяются. Итоговая плазмида содержит все входные фрагменты по одному разу, в указанном порядке.
Участки отжига длиной 16–38, 16–45 или 16–52 нт перебираются для целей 60, 62 или 65 °C. Хвосты — 15–45 нт. Из ограниченного набора выбирается пара с учётом Tm, повторов и вторичных структур. Это не исчерпывающий поиск всех возможных праймеров.
Tm участка отжига и общей гомологии: SantaLucia / Owczarzy, 500 нМ праймера, 50 мМ одновалентных ионов, 1,5 мМ Mg²⁺, 0,8 мМ суммарных dNTP. Это условия модели, а не состав конкретного буфера. Tm не равна температуре отжига ПЦР.
Шпильки и димеры полных праймеров оцениваются с помощью Primer3 2.6.1. Для шпилек длиннее 60 нт и димеров, в которых оба праймера длиннее 60 нт, сохраняется эвристическая оценка. Запас 10 °C при ранжировании — ориентир, а не экспериментальный порог.
На каждом входном фрагменте проверяются обе цепи: точные совпадения, последние 12 нт и участки с 1–2 заменами без вставок и делеций. Для похожих участков отдельно учитывается сохранность последних 5 нт. Это поиск сходства, а не прогноз побочной амплификации. Другие матрицы и геномы не проверяются. В стыках отмечаются полные повторы и совпадения крайних 15 нт с другими стыками; частичная гомология иной длины не исключена.
Расчёт выполняется в браузере. Последовательности не отправляются на сервер. Сохранение в проект — только по вашей команде.