Фьюжн-полимераза

1. Описание

Фьюжн ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную Pfu-полимеразу, слитую с Sso7d ДНК-связывающим доменом. Такой вариант полимеразы дольше остается связанным с ДНК-матрицей во время синтеза, поэтому Фьюжн-полимераза позволяет амплифицировать ДНК быстрее, чем Pfu-полимераза дикого типа, сохраняя низкую частоту ошибок. Фермент получен в штамме E. coli, молекулярная масса 100.2 кДа.

2. Протокол использования

1. Подготовка реакционной смеси

Смешайте компоненты согласно Таблице 1. Если объем реакции мал (<50 мкл), для снижения погрешности полимеразу можно предварительно развести в 1X реакционном буфере. Аккуратно перемешайте смесь переливанием или легким покачиванием.

Компонент Реакционная смесь, 50 мкл Конечная концентрация
5X реакционный буфер 10 мкл 1X
10 мМ dNTP 1 мкл 200 мкМ
Праймеры, 10 мкМ по 1 мкл каждого 0.5 мкМ
ДНК-матрица – 1 пг - 10 нг (плазмидная ДНК)
10-250 нг (геномная ДНК)
Фьюжн-полимераза 0.5 мкл 0.5 ед. на 50 мкл реакции
Вода Milli-Q до 50 мкл –
Таблица 1. Состав реакционной смеси для высокоточной ПЦР

2. Температурная программа

Перенесите пробирку с готовой реакционной смесью в амплификатор (термоциклер) и запустите программу ПЦР в соответствии с параметрами, указанными в Таблице 2.

Этап Температура, °C Время
Предварительная денатурация 96-98 30-60 сек
25-35 циклов Денатурация 96-98 10 сек
Отжиг 50-72 15 сек
Элонгация 72 15-30 сек / 1 т.п.о.
Финальная элонгация 72 1-10 минут
Хранение 4 ∞
Таблица 2. Пример стандартной программы температурного циклирования

3. Советы от R&D отдела

  • Для расчета температуры отжига (Tm) используйте наш калькулятор Tm.
  • Стандартная рабочая температура денатурации — 98°C. Она обеспечивает полное разделение цепей даже на сложных участках без повреждения самого фермента.
  • Рекомендуем использовать следующее количество ДНК на реакцию:
    Геномная ДНК (клетки млекопитающих, растения, грибы): 50–250 нг
    Геномная ДНК (бактерии, дрожжи): 1–10 нг
    Плазмидная ДНК: 1 пг – 10 нг.
  • Избыток матрицы может привести к появлению неспецифических продуктов (шлейфа).
  • Если содержание GC в ампликоне превышает 65%, рекомендуется добавление DMSO (2–8%) для облегчения плавления вторичных структур.

4. Спецификация набора

50 ед.
1 пробирка: 50 мкл Фьюжн-полимеразы;
1 пробирка: 1.5 мл реакционного буфера (5X)
250 ед.
1 пробирка: 250 мкл Фьюжн-полимеразы;
4 пробирки по 1.5 мл реакционного буфера (5X)

5. Характеристики

Активность 1 ед./мкл

6. Состав растворов

5X реакционный буфер содержит 10 мМ MgCl2.

7. Ключевые определения

За одну единицу активности принято количество фермента, необходимое для включения 20 нмоль dNTP в кислотонерастворимую фракцию ДНК за 30 мин при 74°C.

8. Условия хранения

Срок годности — 3 года. Хранить при температуре -20°C. Для реакционного буфера избегать многократных циклов замораживания и размораживания. Рекомендуется сделать аликвоты реакционного буфера для однократного использования.

9. Документация и сертификаты

Подтверждение активности
Подтверждение активности

Рисунок 1. Амплификация фрагментов величиной до 10 т.п.о. М – маркер длин ДНК 1 кб

Подтверждение активности

Рисунок 2. Амплификация матриц с разным GC-составом. М – маркер длин ДНК 1 кб

Решение проблем

🔴 Отсутствие или низкий выход продукта

  • Неоптимальная температура отжига (Tm): используйте градиент температуры для подбора оптимальной. Попробуйте увеличить время отжига праймеров до 30 секунд.
  • Недостаточная денатурация: для сложных матриц увеличьте время предварительной денатурации до 2-3 минут или время денатурации в цикле до 15-20 секунд.
  • Короткое время элонгации: для фрагментов > 5 т.п.о. или сложных матриц используйте расчет 30 сек/т.п.о.
  • Проблемы с матрицей: проверьте концентрацию и чистоту ДНК (отсутствие фенола, этанола, высоких концентраций EDTA). Избыток матрицы может ингибировать реакцию.

🔴 Неспецифическая амплификация (лишние полосы)

  • Слишком низкая Tm: используйте температурный градиент для подбора оптимальной температуры отжига.
  • Время отжига: попробуйте уменьшить время отжига до 10 секунд.
  • Избыток циклов амплификации: попробуйте уменьшить количество циклов до 25–30. Также в некоторых случаях помогает уменьшение объема полимеразы до 0.25 мкл на 50 мкл реакции.
  • Концентрация праймеров: избыток праймеров (> 0.5 мкМ) может приводить к неспецифической амплификации. Оптимизируйте их количество.

🔴 Шмер на геле

  • Избыток циклов: слишком большое количество циклов приводит к накоплению побочных продуктов и реассоциации ДНК.
  • Слишком много ДНК-матрицы: высокая концентрация ДНК может вызвать неспецифическое связывание праймеров по всей длине.
  • Деградация матрицы: убедитесь, что исходная ДНК не фрагментирована.
  • Слишком длинная элонгация: сократите время до 15 сек/т.п.о. Избыточное время работы фермента может привести к деградации продукта за счет 3'→5' экзонуклеазной активности.

🔴 Проблемы со сложными фрагментами (GC-богатые или > 5 т.п.о.)

  • Вторичные структуры: при содержании GC > 65% добавьте в реакцию DMSO (2–8%). Это поможет «плавлению» сложных участков.
  • Дизайн праймеров: для длинных фрагментов выбирайте праймеры длиной 24–30 нуклеотидов с высокой Tm (> 65°C), чтобы проводить отжиг и элонгацию при близких температурах (двухстадийная ПЦР).