Nanopore и Сэнгер: два подхода к проверке плазмид

Для рутинной проверки плазмид Nanopore часто экономит и деньги, и время: одна реакция охватывает плазмиду целиком, без серии специально подобранных праймеров.

Главное различие

Сэнгер проверяет выбранные участки. Nanopore читает плазмиду целиком.

При секвенировании по Сэнгеру участки заранее выбирают с помощью праймеров и получают несколько отдельных фрагментов данных. Последовательность между ними может остаться непроверенной.

Nanopore читает отдельные молекулы по всей длине. Это позволяет проверить вставку, бэкбон и увидеть варианты последовательности в образце.

Сэнгер один участок по заданному праймеру

Nanopore

полная карта и отдельные варианты

Sanger

Nanopore

Плазмида целиком вместо серии чтений

Одно чтение по Сэнгеру обычно охватывает до 800–1000 п. о. Для проверки вставки длиной 5 кб потребуется серия реакций с несколькими праймерами. Nanopore позволяет прочитать плазмиду по всей длине, включая бэкбон.

Математика для вставки 5 кб:

Сэнгер (минимум 8 реакций + праймеры): ~6 000 ₽
Nanopore (плазмида целиком): 3 900 ₽

Sanger

Nanopore

Разделение вариантов в смешанном образце

Если в образце находятся разные варианты плазмиды или димер, хроматограмма Сэнгера может содержать наложенные пики и не дать однозначного результата.

Nanopore регистрирует отдельные молекулы. При достаточном количестве данных варианты можно разделить и оценить их долю в образце.

Sanger

Nanopore

Сложные участки последовательности

Сложная вторичная структура, ITR-повторы и GC-богатые участки могут затруднять получение непрерывного результата по Сэнгеру.

В Nanopore отдельная молекула проходит через пору, поэтому такие участки можно анализировать в контексте полной последовательности. Качество результата по-прежнему зависит от образца и покрытия.

Sanger

Nanopore

Секвенирование без специальных праймеров

Для Сэнгера нужны праймеры к выбранным участкам. Если подходящих праймеров нет, их потребуется подобрать и синтезировать до секвенирования.

Для Nanopore специальные праймеры не требуются. Сборку de novo можно выполнить без опоры на ожидаемую карту, а затем сопоставить результат с проектной последовательностью.

Точность и сборка de novo

Итоговую последовательность собирают по множеству прочтений одной плазмиды. Точность консенсуса зависит от качества образца, покрытия и алгоритма сборки, поэтому результат оценивает специалист.

От множества прочтений к одной последовательности

Схематический пример

01 Прочтения
02 Выравнивание
03 Консенсус
04 Общий масштаб

Совместный анализ прочтений помогает уточнить итоговую последовательность.

Итог в позиции 5 CОснование консенсуса

Результат опирается на множество согласующихся прочтений.

Схема показывает принцип: увеличенный фрагмент — лишь часть большого массива. Масштаб 1 000× выбран для иллюстрации и не задаёт покрытие услуги. Реальный алгоритм учитывает качество данных и контекст последовательности.

Гомополимеры. Длинные повторы одного нуклеотида остаются сложными для интерпретации. Возможная одно- или олигонуклеотидная делеция в таком участке может быть артефактом и при необходимости требует дополнительной проверки.

Сборка de novo. Выравнивание на референс удобно для проверки ожидаемой конструкции, но может не показать изменения, которых нет в исходной карте. Сборка без референса снижает эту зависимость и помогает обнаружить неожиданные варианты последовательности. Сложные участки при этом всё равно могут потребовать дополнительной проверки.

Проверить плазмиду по всей длине

ОФОРМИТЬ ЗАКАЗ →