Клонинг Фасилити — Реактивы для учёных

Инструкция к набору

Т4 ДНК лигаза

Состав набора

Раствор T4 ДНК лигазы

В буфере 20 мМ Tris‑HCl (pH 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ ЭДТА, 50% глицерин, 1 пробирка (40 или 200 мкл).

Раствор T4 ДНК лигазы

В буфере 20 мМ Tris‑HCl (pH 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ ЭДТА, 50% глицерин, 1 пробирка (40 или 200 мкл).

Раствор T4 ДНК лигазы

В буфере 20 мМ Tris‑HCl (pH 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ ЭДТА, 50% глицерин, 1 пробирка (40 или 200 мкл).

Раствор T4 ДНК лигазы

В буфере 20 мМ Tris‑HCl (pH 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ ЭДТА, 50% глицерин, 1 пробирка (40 или 200 мкл).

Раствор T4 ДНК лигазы

В буфере 20 мМ Tris‑HCl (pH 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ ЭДТА, 50% глицерин, 1 пробирка (40 или 200 мкл).

10х буфер

Реакционный буфер, 400 мМ Tris‑HCl, 100 мМ MgCl₂, 100 мМ DTT, 5 мМ АТФ, pH = 7.8, 1 пробирка (0.5 или 1.5 мл).

10х буфер

Реакционный буфер, 400 мМ Tris‑HCl, 100 мМ MgCl₂, 100 мМ DTT, 5 мМ АТФ, pH = 7.8, 1 пробирка (0.5 или 1.5 мл).

10х буфер

Реакционный буфер, 400 мМ Tris‑HCl, 100 мМ MgCl₂, 100 мМ DTT, 5 мМ АТФ, pH = 7.8, 1 пробирка (0.5 или 1.5 мл).

10х буфер

Реакционный буфер, 400 мМ Tris‑HCl, 100 мМ MgCl₂, 100 мМ DTT, 5 мМ АТФ, pH = 7.8, 1 пробирка (0.5 или 1.5 мл).

10х буфер

Реакционный буфер, 400 мМ Tris‑HCl, 100 мМ MgCl₂, 100 мМ DTT, 5 мМ АТФ, pH = 7.8, 1 пробирка (0.5 или 1.5 мл).

Условия хранения и использование

Хранить при ‑20°С. Для реакционного буфера избегать многократных циклов замораживания и размораживания. Рекомендуется сделать аликвоты реакционного буфера для однократного использования.

Условия хранения и использование

Активность

Рекомбинантная Т4 ДНК Лигаза Клонинг Фасилити обладает активностью 5 ед./мкл по Вейсу, что эквивалентно 1000 ед./мкл в единицах лигирования липких концов.

Активность

Протоколы сборки

Протокол сборки по технологии Golden Gate

Протокол клонирования классическим методом «рестрикция — лигирование»

Протокол лигирования по тупым концам (Blunt‑end ligation)

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Лигирование адаптеров

Подготовка реакционной смеси для Golden Gate

50 фмоль акцепторной плазмидной ДНК,

100 фмоль каждой вставки в виде плазмиды или ПЦР‑продукта,

2 мкл 10X реакционного буфера Т4 ДНК лигазы,

1 мкл лигазы,

1 мкл рестриктазы (например, BsaI или другой подходящий фермент),

Вода без нуклеаз: до 20 мкл общего объёма реакции.

Протокол сборки по технологии Golden Gate

В основе метода Golden Gate лежит использование рестриктаз IIs типа, например, BsaI, BpiI или Esp3I, которые разрезают ДНК вне своих сайтов узнавания, создавая уникальные липкие концы. Эти концы позволяют фрагментам ДНК соединяться в заданном порядке бесшовно. После лигирования сайты узнавания рестриктазы исчезают из итоговой последовательности, что делает реакцию необратимой и предотвращает повторное разрезание собранной конструкции.

Кроме того, этот метод клонирования позволяет быстро и точно собирать до 10 и более фрагментов ДНК в одну молекулу одновременно. Golden Gate часто применяется для модульной сборки генов.

Протокол сборки по технологии Golden Gate

1. Проведение реакции Golden Gate

—

Вначале предварительная рестрикция: 37°C — 10 минут.

—

Вначале предварительная рестрикция: 37°C — 10 минут.

—

Вначале предварительная рестрикция: 37°C — 10 минут.

—

Вначале предварительная рестрикция: 37°C — 10 минут.

—

Вначале предварительная рестрикция: 37°C — 10 минут.

—

Затем 30 циклов, где каждый цикл: 37°C (рестрикция) — 1:30 мин, 16°C (лигиpование) — 3 мин.

—

Затем 30 циклов, где каждый цикл: 37°C (рестрикция) — 1:30 мин, 16°C (лигиpование) — 3 мин.

—

Затем 30 циклов, где каждый цикл: 37°C (рестрикция) — 1:30 мин, 16°C (лигиpование) — 3 мин.

—

Затем 30 циклов, где каждый цикл: 37°C (рестрикция) — 1:30 мин, 16°C (лигиpование) — 3 мин.

—

Затем 30 циклов, где каждый цикл: 37°C (рестрикция) — 1:30 мин, 16°C (лигиpование) — 3 мин.

—

После: финальное лигирование 16°C — 15 минут, 50°C — 5 мин (инактивация рестриктазы), 80°C — 5 мин (инактивация лигазы).

—

2. Трансформация компетентных клеток

—

Внести 2 мкл реакционной смеси Golden Gate в 50 мкл компетентных клеток E.coli TOP10.

—

Внести 2 мкл реакционной смеси Golden Gate в 50 мкл компетентных клеток E.coli TOP10.

—

Внести 2 мкл реакционной смеси Golden Gate в 50 мкл компетентных клеток E.coli TOP10.

—

Внести 2 мкл реакционной смеси Golden Gate в 50 мкл компетентных клеток E.coli TOP10.

—

Внести 2 мкл реакционной смеси Golden Gate в 50 мкл компетентных клеток E.coli TOP10.

—

Инкубация на льду: 30 мин.

—

Инкубация на льду: 30 мин.

—

Инкубация на льду: 30 мин.

—

Инкубация на льду: 30 мин.

—

Инкубация на льду: 30 мин.

—

Тепловой шок: 42°C — 90 сек, затем сразу на лед — 2 мин.

—

Тепловой шок: 42°C — 90 сек, затем сразу на лед — 2 мин.

—

Тепловой шок: 42°C — 90 сек, затем сразу на лед — 2 мин.

—

Тепловой шок: 42°C — 90 сек, затем сразу на лед — 2 мин.

—

Тепловой шок: 42°C — 90 сек, затем сразу на лед — 2 мин.

—

Добавить 300 мкл среды SOB.

—

Добавить 300 мкл среды SOB.

—

Добавить 300 мкл среды SOB.

—

Добавить 300 мкл среды SOB.

—

Добавить 300 мкл среды SOB.

—

Инкубировать при 37°C в настольной качалке 1 час для экспрессии антибиотик‑резистентности.

—

Инкубировать при 37°C в настольной качалке 1 час для экспрессии антибиотик‑резистентности.

—

Инкубировать при 37°C в настольной качалке 1 час для экспрессии антибиотик‑резистентности.

—

Инкубировать при 37°C в настольной качалке 1 час для экспрессии антибиотик‑резистентности.

—

Инкубировать при 37°C в настольной качалке 1 час для экспрессии антибиотик‑резистентности.

—

Взять 100 мкл суспензии после восстановления. Равномерно распределить по поверхности LB‑агара с соответствующим антибиотиком.

—

Инкубировать чашку при 37°C в течение ночи.

—

Инкубировать чашку при 37°C в течение ночи.

—

Инкубировать чашку при 37°C в течение ночи.

—

Инкубировать чашку при 37°C в течение ночи.

—

Инкубировать чашку при 37°C в течение ночи.

3. Получение плазмидной ДНК

—

Сколоть несколько клонов белого цвета в жидкую среду с антибиотиком.

—

Сколоть несколько клонов белого цвета в жидкую среду с антибиотиком.

—

Сколоть несколько клонов белого цвета в жидкую среду с антибиотиком.

—

Сколоть несколько клонов белого цвета в жидкую среду с антибиотиком.

—

Сколоть несколько клонов белого цвета в жидкую среду с антибиотиком.

—

Подрастить клеточную культуру в течение 8 часов.

—

Подрастить клеточную культуру в течение 8 часов.

—

Подрастить клеточную культуру в течение 8 часов.

—

Подрастить клеточную культуру в течение 8 часов.

—

Подрастить клеточную культуру в течение 8 часов.

—

Осадить клетки и выделить из них плазмидную ДНК.

—

Осадить клетки и выделить из них плазмидную ДНК.

—

Осадить клетки и выделить из них плазмидную ДНК.

—

Осадить клетки и выделить из них плазмидную ДНК.

—

Осадить клетки и выделить из них плазмидную ДНК.

—

Провести проверку клонов при помощи рестрикционного анализа.

—

Провести проверку клонов при помощи рестрикционного анализа.

—

Провести проверку клонов при помощи рестрикционного анализа.

—

Провести проверку клонов при помощи рестрикционного анализа.

—

Провести проверку клонов при помощи рестрикционного анализа.

Список протоколов

Подготовка реакционной смеси

20–100 нг линейного вектора ДНК,

Вставка ДНК: в мольном соотношении 1:1 до 5:1 по отношению к вектору,

2 мкл 10X реакционного буфера Т4 ДНК лигазы,

1 мкл Т4 ДНК лигазы,

Вода без нуклеаз: до 20 мкл общего объёма реакции.

Протокол клонирования классическим методом «рестрикция — лигирование»

1. Рестрикция вектора и вставки

—

ДНК‑фрагменты обработать рестриктазами, чтобы получить комплементарные липкие концы для лигирования.

—

ДНК‑фрагменты обработать рестриктазами, чтобы получить комплементарные липкие концы для лигирования.

—

ДНК‑фрагменты обработать рестриктазами, чтобы получить комплементарные липкие концы для лигирования.

—

ДНК‑фрагменты обработать рестриктазами, чтобы получить комплементарные липкие концы для лигирования.

—

ДНК‑фрагменты обработать рестриктазами, чтобы получить комплементарные липкие концы для лигирования.

—

Выделить из агарозного геля, вырезав полосу нужного размера под мягким УФ.

—

Выделить из агарозного геля, вырезав полосу нужного размера под мягким УФ.

—

Выделить из агарозного геля, вырезав полосу нужного размера под мягким УФ.

—

Выделить из агарозного геля, вырезав полосу нужного размера под мягким УФ.

—

Выделить из агарозного геля, вырезав полосу нужного размера под мягким УФ.

—

Выделить ДНК из геля на колонке.

—

Выделить ДНК из геля на колонке.

—

Выделить ДНК из геля на колонке.

—

Выделить ДНК из геля на колонке.

—

Выделить ДНК из геля на колонке.

2. Лигирование вставки ДНК в вектор

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 10 минут при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 10 минут при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 10 минут при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 10 минут при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 10 минут при 22°C.

—

Использовать до 5 мкл смеси для трансформации 50 мкл химически компетентных клеток или 1–2 мкл на 50 мкл электрокомпетентных клеток.

—

Список протоколов

Протокол лигирования по тупым концам (Blunt‑end ligation)

Подготовка реакционной смеси

20–100 нг линейного вектора ДНК,

Вставка ДНК: в мольном соотношении 1:1 до 5:1 по отношению к вектору,

2 мкл 10X реакционного буфера Т4 ДНК лигазы,

1 мкл Т4 ДНК лигазы,

Вода без нуклеаз: до 20 мкл общего объёма реакции.

Лигирование по тупым концам (Blunt‑end ligation)

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 1 час при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 1 час при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 1 час при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 1 час при 22°C.

—

Инкубировать подготовленную реакционную смесь 1 час при 22°C.

—

Использовать до 5 мкл смеси для трансформации 50 мкл химически компетентных клеток или 1–2 мкл раствора ДНК на 50 мкл электрокомпетентных клеток.

—

Список протоколов

Подготовка реакционной смеси

10–50 нг линейной ДНК,

2 мкл 10X реакционного буфера Т4 ДНК лигазы,

1 мкл Т4 ДНК лигазы,

Вода без нуклеаз: до 20 мкл общего объема реакции.

Закольцовывание линейной ДНК

—

Подготовить линейную ДНК с 5’‑фосфатными концевыми группами, полученными вследствие рестрикции или фосфорилирования.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Приготовить реакционную смесь.

—

Хорошо перемешать, кратко центрифугировать и инкубировать 10 мин при 22°C.

—

Хорошо перемешать, кратко центрифугировать и инкубировать 10 мин при 22°C.

—

Хорошо перемешать, кратко центрифугировать и инкубировать 10 мин при 22°C.

—

Хорошо перемешать, кратко центрифугировать и инкубировать 10 мин при 22°C.

—

Хорошо перемешать, кратко центрифугировать и инкубировать 10 мин при 22°C.

—

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Примечания:

В качестве вставки в акцептор можно использовать димеры олигонуклеотидов с выступающими концами, лигирование в этом случае образует никованные плазмиды, которые после трансформации в E.coli репарируются в клетке.
Эффективность трансформации можно повысить:
- инактивацией лигазы при 65°C в течение 10 мин или при 70°C в течение 5 мин;
- очисткой ДНК на колонках.
Не превышайте рекомендуемое количество лигазы в смеси.
Связывание лигазы или рестриктазы с ДНК может вызывать сдвиг полос в агарозном геле. Чтобы этого избежать, инкубируйте образцы при 65°C в течение 10 мин и охладите на льду перед загрузкой.
Для эффективной трансформации объем смеси для лигирования не должен превышать 10% от объема компетентных клеток.

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Примечания:

В качестве вставки в акцептор можно использовать димеры олигонуклеотидов с выступающими концами, лигирование в этом случае образует никованные плазмиды, которые после трансформации в E.coli репарируются в клетке.
Эффективность трансформации можно повысить:
- инактивацией лигазы при 65°C в течение 10 мин или при 70°C в течение 5 мин;
- очисткой ДНК на колонках.
Не превышайте рекомендуемое количество лигазы в смеси.
Связывание лигазы или рестриктазы с ДНК может вызывать сдвиг полос в агарозном геле. Чтобы этого избежать, инкубируйте образцы при 65°C в течение 10 мин и охладите на льду перед загрузкой.
Для эффективной трансформации объем смеси для лигирования не должен превышать 10% от объема компетентных клеток.

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Примечания:

В качестве вставки в акцептор можно использовать димеры олигонуклеотидов с выступающими концами, лигирование в этом случае образует никованные плазмиды, которые после трансформации в E.coli репарируются в клетке.
Эффективность трансформации можно повысить:
- инактивацией лигазы при 65°C в течение 10 мин или при 70°C в течение 5 мин;
- очисткой ДНК на колонках.
Не превышайте рекомендуемое количество лигазы в смеси.
Связывание лигазы или рестриктазы с ДНК может вызывать сдвиг полос в агарозном геле. Чтобы этого избежать, инкубируйте образцы при 65°C в течение 10 мин и охладите на льду перед загрузкой.
Для эффективной трансформации объем смеси для лигирования не должен превышать 10% от объема компетентных клеток.

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Примечания:

В качестве вставки в акцептор можно использовать димеры олигонуклеотидов с выступающими концами, лигирование в этом случае образует никованные плазмиды, которые после трансформации в E.coli репарируются в клетке.
Эффективность трансформации можно повысить:
- инактивацией лигазы при 65°C в течение 10 мин или при 70°C в течение 5 мин;
- очисткой ДНК на колонках.
Не превышайте рекомендуемое количество лигазы в смеси.
Связывание лигазы или рестриктазы с ДНК может вызывать сдвиг полос в агарозном геле. Чтобы этого избежать, инкубируйте образцы при 65°C в течение 10 мин и охладите на льду перед загрузкой.
Для эффективной трансформации объем смеси для лигирования не должен превышать 10% от объема компетентных клеток.

Протокол закольцовывания линейной ДНК

Примечания:

В качестве вставки в акцептор можно использовать димеры олигонуклеотидов с выступающими концами, лигирование в этом случае образует никованные плазмиды, которые после трансформации в E.coli репарируются в клетке.
Эффективность трансформации можно повысить:
- инактивацией лигазы при 65°C в течение 10 мин или при 70°C в течение 5 мин;
- очисткой ДНК на колонках.
Не превышайте рекомендуемое количество лигазы в смеси.
Связывание лигазы или рестриктазы с ДНК может вызывать сдвиг полос в агарозном геле. Чтобы этого избежать, инкубируйте образцы при 65°C в течение 10 мин и охладите на льду перед загрузкой.
Для эффективной трансформации объем смеси для лигирования не должен превышать 10% от объема компетентных клеток.

Список протоколов

Лигирование адаптеров

Т4 ДНК лигаза часто используется для добавления адаптеров к фрагментам ДНК по липким A/T концам для последующего захвата и чтения различными платформами секвенирования.

Некоторые протоколы допускают лигирование адаптеров по тупым концам, но эффективность лигирования будет ниже.

Применение Т4 ДНК лигазы зависит от конкретного протокола секвенирования.