Т5-экзонуклеаза

1. Описание

Т5-экзонуклеаза — это нуклеаза бактериофага Т5, экспрессированная в штамме E. coli.

2. Протокол использования

ОЧИСТКА ПЛАЗМИД И GIBSON ASSEMBLY

1. Для удаления линейной ДНК добавьте 1–5 ед. Т5-экзонуклеазы на 1 мкг препарата.

2. Используйте 1X реакционный буфер (содержит Mg2+).

3. Инкубируйте при 37°C в течение 30 минут.

4. Для сборки Гибсона фермент создает одноцепочечные «хвосты» на концах фрагментов.

5. В стандартной смеси Т5 работает в паре с Phusion-полимеразой и Taq-лигазой.

3. Советы от R&D отдела

  • Сверхспирализованная плазмидная ДНК устойчива к Т5, однако если плазмида имеет много «ников», фермент начнет её деградацию. Не передерживайте реакцию более 60 минут.
  • Наличие ЭДТА в концентрациях выше 1 мМ может полностью заблокировать активность, так как фермент требует ионов магния.
  • Фермент сохраняет около 50–70% активности в большинстве стандартных ПЦР-буферов, если в них достаточно Mg2+.
  • T5 отщепляет нуклеотиды в направлении (5' → 3') и расщепляет одноцепочечные кольцевые ДНК.

4. Спецификация набора

500 ед.
1 пробирка: 100 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка: 1 мл 10X реакционного буфера
2 500 ед.
1 пробирка: 500 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка: 1 мл 10X реакционного буфера

5. Характеристики

Активность 5 ед./мкл
Инактивация Нагревание или добавление хелаторов (ЭДТА)

6. Состав растворов

10X реакционный буфер: 500 мМ KOAc (pH 7.9), 200 мМ Tris-OAc, 100 мМ Mg(OAc)2, 10 мМ DTT
Буфер для хранения: 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 0.1 мМ EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% глицерин

7. Ключевые определения

За одну единицу активности принято количество фермента, необходимое для изменения оптической плотности A(260) на 0.00032 за 1 минуту при 37°C.

8. Условия хранения

Срок годности — 2 года. Хранить при -20°C. Буфер для хранения содержит Triton X-100 и TCEP для обеспечения стабильности фермента при многократном использовании.

9. Документация и сертификаты