Т5 экзонуклеаза
1. Описание
2. Протокол использования
ОЧИСТКА ПЛАЗМИД И GIBSON ASSEMBLY
1. Для удаления линейной ДНК добавьте 1–5 ед. Т5 экзонуклеазы на 1 мкг препарата.
2. Используйте 1X реакционный буфер (содержит Mg2+).
3. Инкубируйте при 37°C в течение 30 минут.
4. Для сборки Гибсона фермент создает одноцепочечные «хвосты» на концах фрагментов.
5. В стандартной смеси Т5 работает в паре с Phusion-полимеразой и Taq-лигазой.
3. Советы от R&D отдела
- Сверхспирализованная плазмидная ДНК устойчива к Т5, однако если плазмида имеет много «ников», фермент начнет её деградацию. Не передерживайте реакцию более 60 минут.
- Наличие ЭДТА в концентрациях выше 1 мМ может полностью заблокировать активность, так как фермент требует ионов магния.
- Фермент сохраняет около 50–70% активности в большинстве стандартных ПЦР-буферов, если в них достаточно Mg(2+).
4. Частые вопросы (FAQ)
В: Чем Т5 экзонуклеаза отличается от Экзонуклеазы III?
О: Экзо III работает в направлении 3' → 5' и не имеет эндонуклеазной активности к ssDNA. Т5 работает в противоположном направлении (5' → 3') и расщепляет одноцепочечные кольцевые ДНК.
В: Можно ли использовать Т5 для очистки ПЦР-смеси?
О: Да, она удалит праймеры и линейную матрицу. Однако, если ваш ПЦР-продукт линейный, Т5 деградирует и его.
5. Спецификация набора
1 пробирка : 1 мл 10х реакционного буфера
1 пробирка : 1 мл 10х реакционного буфера
6. Характеристики
| Активность | 5 ед./мкл |
| Инактивация | Нагревание или добавление хелаторов (ЭДТА) |
7. Состав растворов
10X реакционный буфер: 500 мM KOAc (pH 7.9), 200 мM Тris-OAc, 100 мM Mg(OAc)2, 10 мM DTT
Буфер для хранения: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% глицерин
8. Ключевые определения
За одну единицу активности принято количество фермента, необходимое для изменения оптической плотности A(260) на 0.00032 за 1 минуту при 37°C.
9. Условия хранения
Хранить при -20°C. Буфер для хранения содержит Triton X-100 и TCEP для обеспечения стабильности фермента при многократном использовании.