TEV-протеаза

Другое название: TEV protease

1. Описание

TEV-протеаза Клонинг Фасилити — каталитический домен белка NIa вируса гравировки табака (Tobacco Etch Virus) с дополнительными мутациями, экспрессированный в клетках E. coli.

2. Протокол использования

СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ГИДРОЛИЗА

1. Диализовать белок против 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5.

2. К 10-30 мкг белкового субстрата добавить воду до объема 85 мкл.

3. Добавить 10 мкл реакционного буфера (10X) и 1 мкл 100 мМ DTT.

4. Добавить 4 мкл (10 ед.) TEV-протеазы.

5. Инкубировать при 30°C 1 час или при 4°C ночь.

6. Проверить степень расщепления с помощью SDS-PAGE.

3. Советы от R&D отдела

Реакционный буфер может быть заменен на MES, HEPES или фосфатный буфер (pH 6–9), если это необходимо для стабильности вашего белка.
Если образец содержит > 2 M мочевины, > 0.5 M гуанидина или ингибиторы цистеиновых протеаз, необходимо провести диализ перед реакцией.
При 4°C активность снижается примерно в 10 раз, учитывайте это при планировании ночной инкубации.
В особенно трудных случаях соотношение фермента к субстрату может доходить до 1:5.
Если DTT разрушает ваш белок, замените его на систему глутатиона (3 мМ GSH / 0.3 мМ GSSG).
Протеаза содержит 6xHis-tag, поэтому от нее можно избавиться с помощью Ni-NTA или других видов МАХ.

4. Спецификация набора

1000 ед.

1 пробирка: 400 мкл раствора TEV-протеазы;
1 пробирка: 1 мл 20X реакционного буфера;
1 пробирка: 200 мкл 100X раствора 0.1 М DTT;
1 пробирка: 50 мкл раствора контрольного белка (2 мкг/мкл)

5. Характеристики

Активность	2.5 ед./мкл
Инактивация	10 мин при 65°C

6. Состав растворов

Буфер для хранения: 25 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 200 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ бета-меркаптоэтанол, 50% глицерин
Реакционный буфер (20X): 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ ЭДТА
Буфер для хранения контрольного белка: 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT

7. Ключевые определения

За одну единицу активности принято количество фермента, необходимое для расщепления 1 мкг химерного рекомбинантного белка (~54.7 кДа mScarlet3-mNeonGreen) до глубины гидролиза 90% в общем реакционном объеме 10 мкл за 1 час при 25°C в стандартном реакционном буфере.

8. Условия хранения

Срок годности — 1 год. Рекомбинантная TEV-протеаза остается стабильной до 1 года при -20°C. Допускается транспортировка при температуре до +8°C в течение 24 часов. Избегайте повторяющихся циклов оттаивания-замораживания, а также замораживания при -70°C.