TEV-протеаза
1. Описание
2. Протокол использования
СТАНДАРТНЫЙ ПРОТОКОЛ ГИДРОЛИЗА
1. Диализовать белок против 20 мМ Tris-HCl, pH 7.5
2. К 10-30 μg белкового субстрата добавить воду до объема 85 μl.
3. Добавить 10 μl Реакционного буфера (10X) и 1 μl 100 мМ DTT.
4. Добавить 4 μl (10 ед.) TEV протезы.
5. Инкубировать при 30°C 1 час или при 4°C ночь.
6. Проверить степень расщепления с помощью SDS-PAGE.
3. Советы от R&D отдела
- Реакционный буфер может быть заменен на MES, HEPES или фосфатный буфер (pH 6–9), если это необходимо для стабильности вашего белка.
- Если образец содержит > 2 M мочевины, > 0.5 M гуанидина или ингибиторы цистеиновых протеаз, необходимо провести диализ перед реакцией.
- При 4°C активность снижается примерно в 10 раз, учитывайте это при планировании ночной инкубации.
- В особенно трудных случаях соотношение фермента к субстрату может доходить до 1:5.
4. Частые вопросы (FAQ)
В: Мой белок содержит дисульфидные связи. Нужно ли добавлять DTT?
О: TEV — это цистеиновая протеаза, ей нужна восстановительная среда. Если DTT разрушает ваш белок, замените его на систему глутатиона (3 мМ GSH / 0.3 мМ GSSG).
В: Почему протеаза не режет мой белок, хотя сайт на месте?
О: Скорее всего, сайт ENLYFQ «спрятан» внутри глобулы. Попробуйте добавить гибкий линкер или провести реакцию в присутствии до 2М мочевины.
В: Как полностью избавиться от протеазы после реакции?
О: Наша протеаза содержит 6xHis-tag. Просто нанесите реакционную смесь на Ni-NTA смолу. Перед этим удалите DTT и ЭДТА диализом.
5. Спецификация набора
1 пробирка: 1 мл 20х Реакционный буфер;
1 пробирка: 200 мкл 100x раствор 0.1М DTT;
1 пробирка: 50 мкл раствора контрольного белка (2 мкг/мкл)
6. Характеристики
| Активность | 2.5 ед./мкл |
| Инактивация | 10 мин при 65°С |
7. Состав растворов
Буфер для хранения: 25 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 200 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ бета-меркаптоэтанол, 50% глицерин
Реакционный буфер (20х): 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ ЭДТА
Буфер для хранения контрольного белка: 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT
8. Ключевые определения
Одна единица активности соответствует количеству фермента, необходимому для расщепления 1 мкг химерного рекомбинантного белка (~54,7 кДа mScarlet3-mNeonGreen) до глубины гидролиза 90% в общем реакционном объеме 10 мкл за 1 час при 25°С в стандартном реакционном буфере.
9. Условия хранения
Рекомбинантная TEV-протеаза остается стабильной до 1 года при -20°С. Допускается транспортировка при температуре до +8°С в течение 24 часов. Избегайте повторяющихся циклов оттаивания-замораживания, а также замораживания при -70°С.