Протеаза Kex2

1. Описание

Kex2 — высокоспецифичная Ca2+-зависимая сериновая эндопротеаза из дрожжей S. cerevisiae, экспрессированная в P. pastoris. Представлена смесью трех белков массой 93 кДа, 72 кДа и 55 кДа

2. Протокол использования

ПРОТЕОЛИЗ В РАСТВОРЕ

1. Лиофилизат растворить в 150 мкл деионизованной воды.

2. Добавьте Kex2 в массовом соотношении от 1:100 до 1:10 (фермент : субстрат).

3. pH реакционной смеси должен быть 8.0, а также обязательно должны быть ионы Ca2+ (0-5 мМ).

4. Инкубируйте 1 час при 30°C.

5. Для остановки реакции можно использовать ЭДТА или Zn2+ в конечной концентрации 100мМ

3. Советы от R&D отдела

  • Kex2 критически зависит от ионов кальция. Наличие даже небольших количеств ЭДТА в буфере с целевым белком может блокировать работу протеазы.
  • Избегайте присутствия тяжелых металлов, которые являются ингибиторами Kex2.
  • Для повышения стабильности при работе разбавляйте концентрат в 10–50 раз специальным буфером (20 мМ NaOAc, 2 мМ CaCl2, 0.1% BSA, pH 5.2). В таком виде фермент сохраняет 90% активности в течение суток при комнатной температуре.

4. Частые вопросы (FAQ)

В: В чем преимущество вашей Kex2 перед "диким" типом?

О: Препараты Kex2 без мутаций крайне нестабильны и быстро теряют активность из-за автопротеолиза. Наша версия с мутациями позволяет проводить длительные инкубации и работать с ферментом при 25–30°C без существенных потерь.

В: Как удалить Kex2 после завершения порезки?

О: Поскольку наш фермент содержит 6xHis-tag, его можно легко удалить с помощью металл-хелатной хроматографии (Ni-NTA смола). Это особенно удобно, если ваш целевой белок не имеет гистидинового тега — тогда он просто выйдет в проскоке.

5. Характеристики

Активность 6 ед./мг
Инактивация 100 мМ ЭДТА или 100 мМ Zn2+

6. Спецификация набора

0.8 ед
1 пробирка: лиофилизат белка в буфере 20 мМ NaOAc, 2 мМ CaCl2, 0.1% трегалозы, pH = 5.2

7. Состав растворов

Буфер для хранения: 20 мМ NaOAc, 2 мМ CaCl2, 0.1% BSA, pH 5.2

8. Ключевые определения

За единицу активности принято количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25°С и pH=8.0. Для определения активности Kex2 использовали пептидный субстрат, содержащий на C‑конце хромогенную группу pNA (п‑нитроанилин), с максимумом поглощения 405 нм.

9. Условия хранения

Лиофилизат можно хранить при +4°С, разведенный белок в буфере для хранения при ‑20°С.

10. Документация и сертификаты