PNGase F
1. Описание
2. Протокол использования
Дегликозилирование белков в денатурирующих условиях для электрофореза в полиакриламидном геле
Стадия денатурации
1. Приготовить раствор 10–50 мкг исследуемого белка в воде (или совместимом буфере с низкой ионной силой) с конечным объемом 30 мкл. Концентрация соли в образце не должна превышать 50 мМ.
2. Добавить 5 мкл 10х денатурирующего буфера.
3. Нагреть образец до 98°C. Инкубировать 10 мин.
4. Охладить образец 5 мин до комнатной температуры.
Стадия дегликозилирования
1. Добавить 5 мкл 0.5 М калий-фосфатного буфера (pH 7.5). Можно использовать другие буферы с подходящим pH в диапазоне 6–10.
2. Добавить 5 мкл 10% Triton X-100.
3. Добавить 1–2 мкл PNGase F.
4. Инкубировать при 37°C 1–3 часа.
Дегликозилирование белков в нативных условиях для масс-спектрометрического анализа
1. Растворить 1–20 мкг гликопротеина в 50 мМ бикарбонате аммония (pH 7.8) до конечного объема 18 мкл.
2. Добавить 2–5 мкл PNGase F. Если используется препарат с глицерином, рекомендуется добавлять его в объеме не более 1/10 от общего объема реакции, чтобы конечная концентрация глицерина не превышала 5%.
3. Инкубировать 4–24 часа при 37°C.
3. Советы от R&D отдела
- Детергенты и тепловая денатурация исследуемого белка повышают скорость катализируемой реакции на 1–2 порядка.
- Фермент способен дегликозилировать белки и в отсутствие денатурирующих веществ, но нуждается в более длительной инкубации (12–24 часа) или большем количестве фермента на реакцию для расщепления нативных неденатурированных белков.
- Оптимальный pH 8.6, но фермент сохраняет до 60% активности в диапазоне pH от 6 до 9.5.
- Приведенные протоколы предназначены в качестве общего руководства по дегликозилированию белков. Активность в отношении различных гликопротеиновых субстратов в значительной степени зависит от условий реакции и должна определяться эмпирическим путем.
4. Спецификация набора
1 пробирка: 1 мл 0.5 М калий-фосфатного буфера, pH 7.5
1 пробирка: 1 мл 10% Triton X-100
1 пробирка: 1 мл 10X денатурирующего буфера, 5% SDS, 0.5 M DTT, pH 8.6
5. Характеристики
| Активность | 1000 ед.а./мкл |
| Инактивация | 98°C, 10 мин |
6. Состав растворов
Буфер для хранения: 20 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA.
7. Ключевые определения
За одну единицу активности принято количество N-гликозидазы PNGase F, необходимое для удаления >95% олигосахаридных остатков 10 мкг денатурированной РНКазы B за 1 час при 37°C в общем объеме реакции 10 мкл.
8. Условия хранения
Срок годности — 2 года. Хранить при температуре от +2°C до +10°C. Не замораживать.