Рестриктаза NotI CutFast

1. Описание

NotI — улучшенная версия эндонуклеазы NotI из Nocardia otitidis-caviarum, с увеличенной удельной активностью и специфичностью, экспрессированная в клетках E. coli.

2. Протокол использования

Стандартная рестрикция

1. Смешайте: ДНК (200–1000 нг), 2 мкл 10X CutFast Buffer, воды до 19 мкл.

2. Добавьте 1 мкл рестриктазы.

3. Инкубируйте при 37°C 30–60 минут.

3. Советы от R&D отдела

  • На эффективность рестрикции сильно влияет чистота выделенной плазмиды. Наличие этанола, изопропанола, фенола или хлороформа, сорбента для выделения ДНК сильно снижают активность рестриктазы.
  • Во избежание появления неспецифической активности не рекомендуется добавлять фермент больше чем 10% от объема реакционной смеси
  • Для препаративной рестрикции при количестве ДНК более 1 мкг необходимо подобрать общий объем реакции так, чтобы итоговая концентрация ДНК была 100-150 нг/мкл. На 100 мкл реакционной смеси следует добавлять не менее 2 мкл NotI.
  • Избегайте многократных циклов замораживания-размораживания для реакционного буфера (рекомендуется аликвотирование).

4. Частые вопросы (FAQ)

В: Могу ли я использовать NotI в буферах для других рестриктаз?

О: Да. NotI CutFast на 100% активен в универсальном буфере типа CutSmart.

В: Влияет ли CpG метилирование на работу фермента?

О: Да, CpG-метилирование блокирует расщепление, Dam и Dcm на активность не влияют.

В: Почему лигирование после NotI идет плохо?

О: Убедитесь, что вы полностью инактивировали рестриктазу (80°C, 20 мин) перед добавлением лигазы, иначе NotI разрежет лигированные фрагменты обратно.

5. Спецификация набора

50 реакций
1 пробирка: 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 0.5 мл 10х реакционного буфера
1 пробирка: 0.5 мл буфера для нанесения ДНК Нуар
150 реакций
3 пробирки по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 1.5 мл 10х реакционного буфера
1 пробирка: 1.5 мл буфера для нанесения ДНК Нуар
250 реакций
5 пробирок по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 1.5 мл 10х реакционного буфера

6. Характеристики

Активность 20 ед./мкл
Инактивация Полная инактивация при 80°C, 20 мин

7. Состав растворов

Буфер для хранения: 10 мМ Тris‑HCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ EDTA, 200 мкг/мл БСА, 50% Глицерин, pH=7.4
Буфер CutFast (10×): 500 мМ KOAc, 200 мМ Tris-OAc, 100 мМ Mg(OAc)2, 1 мг/мл БСА, pH 7.9

8. Ключевые определения

За одну единицу активности принято количество рестриктазы, которое за 60 минут при 37°C полностью расщепляет 1 мкг контрольной плазмидной ДНК с 2 сайтами рестрикции в реакционном объеме 50 мкл.

9. Условия хранения

Фермент и реакционный буфер необходимо хранить при температуре -20°C

10. Документация и сертификаты