Непрозин

1. Описание

Непрозин — это секретируемая пролил-эндопротеаза, изначально обнаруженная в ловчих кувшинах растений рода Nepenthes, экспрессированная в P. pastoris.

2. Протокол использования

ПРОТЕОЛИЗ В РАСТВОРЕ

1. Лиофилизат (50 мкг) растворить в 1 мл деионизованной воды.

2. Смешать: 1–10 мкг белка, 10 мкл 10X реакционного буфера, 20 мкл восстановленного раствора непрозина.

3. Довести водой до 100 мкл.

4. Инкубировать 15–60 мин при 37–50°C.

5. Добавить 20 мкл 5X буфера для остановки реакции.

ПРОТЕОЛИЗ В ГЕЛЕ (ПААГ)

1. Поместите кусочек геля (~1 мм³) в пробирку.

2. Добавьте 10 мкл 10X буфера, 20 мкл непрозина и 70 мкл воды.

3. Инкубируйте 15–60 мин при выбранной температуре.

3. Советы от R&D отдела

  • Для максимальной эффективности расщепления «жестких» белков предварительно инкубируйте субстрат с 10 мМ DTT в течение 30 минут при 50°C.
  • Оптимальное соотношение фермент : субстрат составляет от 1:5 до 1:50. Для новых объектов рекомендуется начинать с 1:20.
  • Эффективность протеолиза критически зависит от кислотности. Убедитесь, что финальное значение pH смеси находится в диапазоне 2.0–3.0.
  • Фермент устойчив к большинству стандартных ингибиторов, однако 10 мМ пепстатина снижает его активность примерно вдвое.
  • Восстановленный фермент стабилен несколько месяцев при -20°C . Главное — избегать повторных циклов заморозки-разморозки, которые ведут к потере активности.

4. Спецификация набора

1000 ед.
1 пробирка: лиофилизат белка (получен из раствора в буфере 20 мМ Bis‑Tris, 80 мМ NaCl, pH=7.2)

5. Характеристики

Активность 20 ед./мг
Инактивация Не инактивируется большинством известных ингибиторов протеаз, кроме пепстатина

6. Состав растворов

Реакционный буфер (10х): 1М Gly‑HCl, pH=2.5
5x СТОП Буфер: 1M Tris‑HCl, pH=8.4

7. Ключевые определения

За единицу активности было принято количество фермента, которое расщепляет 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 37°С и pH=2.5.

8. Условия хранения

Срок годности 1 год. Лиофилизат хранить при -20°C. Аликвоты разведенного фермента хранить при -20°C. Избегайте повторных циклов заморозки-разморозки. Не храните аликвоты в объеме менее 10 мкл.

9. Документация и сертификаты