КЛД Микс

1. Описание

КЛД Микс — смесь ферментов киназы, лигазы и DpnI в оптимизированном буфере для обработки ПЦР-продуктов после сайт-направленного мутагенеза. КЛД Микс применяется для получения замен, делеций и инсерций в плазмидной ДНК. После амплификации целевого фрагмента ДНК смесь ферментов обеспечивает фосфорилирование концов ДНК, лигирование ПЦР-продукта и удаление исходной метилированной матрицы в одной реакционной смеси. Набор предназначен для работы с линейными двуцепочечными ПЦР-продуктами, полученными при амплификации плазмидной ДНК высокоточной ДНК-полимеразой.

2. Протокол использования

Протокол использования

1. Приготовить следующую реакционную смесь: 1 мкл реакционного буфера КЛД, 1 мкл ПЦР-продукта, 1 мкл КЛД Микс, 7 мкл воды без нуклеаз.

2. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре.

3. Использовать 5 мкл смеси для трансформации 50 мкл химически компетентных клеток.

3. Советы от R&D отдела

  • Используйте минимальное количество матричной ДНК в ПЦР (стандартно - 1 нг на 50 мкл реакцию)
  • Не превышайте объем ПЦР-продукта для КЛД реакции (стандартно - 1 мкл ПЦР продукта на 10 мкл реакцию). Увеличение количества ПЦР-продукта может привести к снижению эффективности трансформации.
  • Если количество целевого ПЦР-продукта низкое, можно увеличить его количество в реакции КЛД (не более 5 мкл на 10 мкл реакцию). Однако, в этом случае необходима предварительная очистка ПЦР-продукта.
  • Используйте высокоточную полимеразу и убедиться в отсутствии неспецифической амплификации в ПЦР-продукте.
  • КЛД Микс обеспечивает фосфорилирование 5’-концов ПЦР-продукта, лигирование фрагмента в кольцевую форму и деградацию исходной ДНК-матрицы рестриктазой DpnI.
  • Идеально подходит для сайт-направленного мутагенеза. Проведите ПЦР с мутантными праймерами (вставки/замены/делеции), а затем используйте микс для лигирования и удаления исходной матрицы.
  • При дизайне праймеров точечные замены располагайте внутри, вставки — на 5'-конце, а для делеций фланкируйте удаляемый участок. Следите за отсутствием вторичных структур и подбирайте близкие температуры отжига.
  • Очистка ПЦР-продукта до или после инкубации с КЛД Миксом не требуется.
  • Стандартное время реакции — 30 минут. Инкубацию можно продлить до 2 часов, однако обычно это не приводит к существенному увеличению эффективности.
  • Для большинства ПЦР-продуктов достаточно 1 мкл. Оптимизация объема может потребоваться только для длинных фрагментов (>10 кб) или при очень низком выходе ПЦР.
  • Не используйте для трансформации более 5 мкл реакционной смеси. Если необходимо взять больший объем, предварительно проведите ферментативную очистку.

4. Спецификация набора

50 реакций
1 пробирка: 50 мкл фермента
1 пробирка: 100 мкл 10x реакционного буфера

5. Характеристики

Характеристики не указаны

6. Состав растворов

Информация отсутствует

7. Ключевые определения

Под одной реакцией подразумевается 1 мкл КЛД Микса, 1 мкл 10х реакционного буфера, а также ДНК и воды в конечном объеме 10 мкл

8. Условия хранения

Ферменты и реакционный буфер необходимо хранить при температуре -20°C. Для реакционного буфера рекомендуется сделать аликвоты для однократного использования.

9. Документация и сертификаты