Рестриктаза HindIII
1. Описание
2. Протокол использования
Стандартная рестрикция
1. Смешайте: ДНК (200–1000 нг), 2 мкл 10X CutFast Buffer, воды до 19 мкл.
2. Добавьте 1 мкл рестриктазы.
3. Инкубируйте при 37°C 30–60 минут.
3. Советы от R&D отдела
- На эффективность рестрикции сильно влияет чистота выделенной плазмиды (остатки этанола или фенола снижают активность).
- Во избежание появления звездчатой активности не рекомендуется добавлять фермент в объеме более 10% от общей реакционной смеси.
- Для препаративной рестрикции (ДНК > 1 мкг) подбирайте объем так, чтобы концентрация ДНК была 100-150 нг/мкл.
- На 100 мкл реакционной смеси рекомендуется добавлять не менее 3 мкл HindIII.
4. Частые вопросы (FAQ)
В: Я вижу дополнительные полосы на геле («шмер»). В чем причина?
О: Если в буфере для нанесения нет SDS, а фермент не был инактивирован, ДНК может оставаться связанной с рестриктазой. Используйте буфер с SDS или прогрейте пробу.
В: Зависит ли работа HindIII от метилирования?
О: HindIII нечувствителен к Dam и Dcm метилированию, однако работа может быть заблокирована CpG-метилированием, если сайт перекрывается с CpG-динуклеотидом.
В: Почему лигирование после HindIII идет плохо?
О: Убедитесь, что вы полностью инактивировали рестриктазу (80°C, 20 мин) перед добавлением лигазы, иначе HindIII разрежет лигированные фрагменты обратно.
5. Спецификация набора
1 пробирка : 1.5 мл 10х реакционного буфера
2 пробирки по 1.5 мл 10х реакционного буфера
6. Характеристики
| Активность | 10 ед./мкл |
| Инактивация | 80°C, 20 мин |
7. Состав растворов
Буфер для хранения: 10 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 250 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ EDTA, 500 мкг/мл БСА, 50% Глицерин
10× CutFast буфер: 500 мM KOAc, 200 мM Tris-OAc, 100 мM Mg(OAc)2, 1 мг/мл БСА, pH 7.9
8. Ключевые определения
За одну единицу активности принято количество фермента, которое за 60 минут при 37°C полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага λ в реакционном объеме 50 мкл.
9. Условия хранения
Фермент и реакционный буфер необходимо хранить при температуре -20°C. Для буфера избегайте многократных циклов замораживания-размораживания. Рекомендуется сделать аликвоты CutFast по 10-50 мкл.