Рестриктаза DpnI

1. Описание

DpnI — эндонуклеаза рестрикции из Diplococcus pneumoniae G41, экспрессированная в клетках E. coli. Изошизомер: MalI.

2. Протокол использования

Удаление матрицы после ПЦР

1. Добавьте 1 мкл DpnI напрямую в ПЦР-смесь (20–50 мкл) по завершении реакции.

2. Инкубируйте при 37°C в течение 15 минут.

Стандартная рестрикция

1. Смешайте: ДНК 1000 нг, 5 мкл 10X CutFast Buffer, воды до 49 мкл.

2. Добавьте 1 мкл рестриктазы.

3. Инкубируйте при 37°C 30–60 минут.

3. Советы от R&D отдела

  • На эффективность рестрикции сильно влияет чистота выделенной плазмиды. Наличие этанола, изопропанола, фенола или хлороформа, сорбента для выделения ДНК сильно снижают активность рестриктазы.
  • Во избежание появления неспецифической активности не рекомендуется добавлять фермент больше чем 10% от объема реакционной смеси.
  • Для препаративной рестрикции при количестве ДНК более 1 мкг необходимо подобрать общий объем реакции так, чтобы итоговая концентрация ДНК была 100-150 нг/мкл. На 100 мкл реакционной смеси следует добавлять не менее 2 мкл DpnI.
  • Избегайте многократных циклов замораживания-размораживания для реакционного буфера (рекомендуется аликвотирование).
  • CpG-метилирование может блокировать расщепление, если оно перекрывается с сайтом узнавания. Если вы работаете с геномной ДНК млекопитающих, учитывайте этот факт.

4. Спецификация набора

50 реакций
1 пробирка: 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка: 0.5 мл 10X реакционного буфера
1 пробирка: 1.5 мл 6X буфера для нанесения ДНК Нуар
150 реакций
3 пробирки по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка: 1.5 мл 10X реакционного буфера
1 пробирка: 1.5 мл 6X буфера для нанесения ДНК Нуар
250 реакций
5 пробирок по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка: 1.5 мл 10X реакционного буфера

5. Характеристики

Активность 2 ед./мкл
Инактивация Полная инактивация при 80°C, 20 мин

6. Состав растворов

Буфер для хранения: 25 мМ HEPES, 250 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ EDTA, 50% глицерин, pH 7.4
Буфер CutFast (10X): 500 мМ KOAc, 200 мМ Tris-OAc, 100 мМ Mg(OAc)2, 1 мг/мл БСА, pH 7.9

7. Ключевые определения

За одну единицу активности принято такое количество фермента, которое полностью гидролизует 1 мкг контрольной плазмиды при 37°C за 1 час в объеме реакции 50 мкл.

8. Условия хранения

Срок годности — 1 год. Фермент и реакционный буфер необходимо хранить при температуре -20°C.

9. Документация и сертификаты