Рестриктаза DpnI

1. Описание

DpnI — эндонуклеаза рестрикции из Diplococcus pneumoniae G41, экспрессированная в клетках Escherichia coli. Изошизомер: MalI

2. Протокол использования

Удаление матрицы после ПЦР

1. Добавьте 1 мкл DpnI напрямую в ПЦР-смесь (20–50 мкл) по завершении реакции.

2. Инкубируйте при 37°C в течение 15 минут.

Стандартная рестрикция

1. Смешайте: ДНК (200–1000 нг), 2 мкл 10X CutFast Buffer, воды до 19 мкл.

2. Добавьте 1 мкл рестриктазы.

3. Инкубируйте при 37°C 30–60 минут.

3. Советы от R&D отдела

  • На эффективность рестрикции сильно влияет чистота выделенной плазмиды. Наличие этанола, изопропанола, фенола или хлороформа, сорбента для выделения ДНК сильно снижают активность рестриктазы.
  • Во избежание появления неспецифической активности не рекомендуется добавлять фермент больше чем 10% от объема реакционной смеси
  • Для препаративной рестрикции при количестве ДНК более 1 мкг необходимо подобрать общий объем реакции так, чтобы итоговая концентрация ДНК была 100-150 нг/мкл. На 100 мкл реакционной смеси следует добавлять не менее 2 мкл DpnI.
  • Избегайте многократных циклов замораживания-размораживания для реакционного буфера (рекомендуется аликвотирование).

4. Частые вопросы (FAQ)

В: Могу ли я использовать DpnI, если моя плазмида выделена из штамма JM110?

О: Нет. Штаммы типа JM110 или SCS110 являются dam-. ДНК в них не метилируется, и DpnI не найдет свой сайт. Используйте стандартные лабораторные штаммы (DH5α, XL1-Blue, Top10).

В: Влияет ли CpG метилирование на работу фермента?

О: Да, CpG-метилирование может блокировать расщепление, если оно перекрывается с сайтом узнавания. Если вы работаете с геномной ДНК млекопитающих, учитывайте этот факт.

В: Почему после обработки DpnI я всё равно вижу колонии с исходной плазмидой?

О: Чаще всего это происходит из-за неполной инкубации. Убедитесь, что вы используете свежий фермент.

5. Спецификация набора

50 реакций
1 пробирка: 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 0.5 мл 10х реакционного буфера
150 реакций
3 пробирки по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 1.5 мл 10х реакционного буфера
250 реакций
5 пробирок по 50 мкл фермента в буфере для хранения
1 пробирка : 1.5 мл 10х реакционного буфера

6. Характеристики

Активность 2 ед./мкл
Инактивация Полная инактивация при 80°C, 20 мин

7. Состав растворов

Буфер для хранения: 25 мМ HEPES, 250 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0.1 мМ EDTA, 50% Глицерин, pH 7.4
Буфер CutFast (10×): 500 мМ KOAc, 200 мМ Tris-OAc, 100 мМ Mg(OAc)2, 1 мг/мл БСА, pH 7.9

8. Ключевые определения

За одну единицу активности принято такое количество фермента, которое полностью гидролизует 1 мкг контрольной плазмиды при 37°C за 1 час в объеме реакции 50 мкл.

9. Условия хранения

Фермент и реакционный буфер необходимо хранить при температуре -20°C

10. Документация и сертификаты